Cromatografia:Standarización
Los valores de RF dependen de muchas variables que deben ser observadas para obtener resultados
reproducibles. A esto se le llama: Normalización o Standarización.
1.-Fase Estacionaria:
a.-Tamañoç
El tamaño de las partículas del adsorbente (ej.silica gel) es importante ya que a menor tamaño de partícula
tendré mayor superficie de contacto, y más proximidad entre las mismas , con lo que hay más equilibrios
Esta cantidad de agua presente en la placa, si es excesiva, implicará fenómenos simultáneos de
partición y de adsorción, restándole efectividad al proceso cromatográfico y haciendo los RF aleatorios,
según el agua adsorbida.
Se pueden usar FM que contengan hasta un 20 % de agua en su composición (siempre que se forme
una FM homogénea) y se utilizan en el caso de Drogas Vegetales para compuestos polares como ser
heterósidos. Para que el Rf sea reproducible, la placa debe estar activada previamente y la cantidad
de agua en la FM en una proporción determinada.
2.-Temperatura:
3.- Fase Móvil:
se están desplazando.
reproducibles. A esto se le llama: Normalización o Standarización.
1.-Fase Estacionaria:
a.-Tamañoç
El tamaño de las partículas del adsorbente (ej.silica gel) es importante ya que a menor tamaño de partícula
tendré mayor superficie de contacto, y más proximidad entre las mismas , con lo que hay más equilibrios
cromatográficos y se producen mas rápido. Si la partícula de Fe es más grande, tengo menos superficie
de contacto por una misma área de FE con lo que tengo menos equilibrios cromatográficos. Además altener menos sitios activos las sustancias son arrastradas por la FM con lo que ocurren fenómenos dedifusión dando irregularidades en las manchas que observamos.
b.-Homogeneidad:
La homogeneidad de la FE es otro factor a tener en cuenta: una capa irregular de la FE dará distintas
velocidades de movimiento de las sustancias. en los lugares donde la capa es fina el movimiento será
rápido,mientras que en los lugares donde está engrosada, las sustancias se quedarán retenidas,
moviéndose mas lentamente, con lo que se obtienen Rf aleatorios e irreproducibles en columna la
homogeneidad está dada por el empaquetamiento uniforme de la misma con la FE.
c.- Activación de la FE
La disminución de la actividad de la FE se debe a que los sitios activos de su superficie puedenestar bloqueados con agua, proveniente de la humedad del medio ambiente.
Esta cantidad de agua presente en la placa, si es excesiva, implicará fenómenos simultáneos de
partición y de adsorción, restándole efectividad al proceso cromatográfico y haciendo los RF aleatorios,
según el agua adsorbida.
Se pueden usar FM que contengan hasta un 20 % de agua en su composición (siempre que se forme
una FM homogénea) y se utilizan en el caso de Drogas Vegetales para compuestos polares como ser
heterósidos. Para que el Rf sea reproducible, la placa debe estar activada previamente y la cantidad
de agua en la FM en una proporción determinada.
2.-Temperatura:
La temperatura afecta la solubilidad y la volatilidad, por lo que debe ser constante durante el desarrollo de la cromatografía para no tener variaciones del Rf
3.- Fase Móvil:
a. Saturación de la cuba
La cuba donde se desarrolla la cromatografía debe estar saturada con los vapores de los solventes de
la FM.
Si la cuba no está debidamente saturada , los solventes, en vez de ascender por capilaridad continuamente
por la placa, tenderán a evaporarse de la misma para equilibrar al líquido con su presión de vapor:
Esto implicará un ascenso no homogéneo del frente del solvente,con un consecuente ascenso irregular
e la sustancia.
Como la evaporación es superficial, en un mismo punto de la placa, tendremos más cantidad de solventeen la parte mas interna y menos en la superficie, dando otra vez un avance irregular de los solutos que
se están desplazando.
Si uso mezclas de solventes la situación se agrava ya que las volatilidades relativas de los solventes
pueden ser diferentes.
Esto implica la evaporación inicial en mayor proporción del solvente más volátil y por ende una diferente
proporción en la polaridad de la FM de desarrollo
El conjunto de estos problemas se deben en si, a la llamda Fase gaseosa, tan temida por los
cromatografistas:
Se solucionan o se disminuyen , con una cuba saturada en forma homogénea, para ello se debe dejar
saturando unos 20 a 30 minutos. Muchas veces se adiciona un papel de filtro a las paredes de la cuba,
que se embebe con la FM de desarrollo.
b. FM homogénea
Si utilizo una mezcla de solventes, éstos deben estar en una proporción en la que sean miscibles entre sí,
ya que si presenta dos fases, el movimiento de las sutancias sería aleatorio e irreproducible.
c. FM anhidra
Los solventes deben ser anhidros , deben conservarse siempre hermeticamente cerrados para que no
absorban agua, ya que esto resultará en un bloqueo de los sitios activos al desarrollar el cromatograma,
con Rf aleatorios y no reproducibles4.- Cantidad de sustancia
La solución a sembrar debe ser lo más concentrada posible, y con el solvente de menor fuerza posible en
que la muestra se disuelva (debe normalizarse tambien este solvente)
Cuando esta solución se pone en contacto con la FE, los sitios activos de la placa adsorberán tanto a la
sustancia como al solvente, en una relación que dependerá de sus respectivas estructuras y afinidades.
Es por ello que la siembra se realiza bajo corriente de aire caliente, para evaporar en lo posible el solvente
y que no se una tanto a la FE.
A medida que los sitios activos se saturen, la adsorción de la FE disminuye, hasta que se hace nula
cuando todos los sitios activos están unidos a muestra o solvente.
Este es el momento en que tenemos la carga máxima de sustancia, toda sustancia que se siga sembrando
estará desorbida de la FE desde el primer momento , por lo tanto no participará del equilibrio
cromatográfico y no se separará.
Esto se traduce en manchas deformadas, "con cola" y de Rf no reproducible.5- Impurezas
Tanto la FE como los solventes de la FM deben ser de calidad cromatográfica, es decir libres de
impurezas que podrían interferir en el movimiento de las sustancias y sus Rf.
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